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非 WHO 參考材料

百日咳博德特氏菌抗 FHA 血清（綿羊）

NIBSC 97/564

本材料不適用于體外診斷。

1. 預期用途

在綿羊中制備抗血清以純化百日咳博德特氏菌絲狀血凝素并用于無細胞百日咳疫苗的對照測試。

2. 注意

該制劑不適用于人類食物鏈中的人類或動物。

該材料不是人或牛來源。與所有生物來源的材料一樣，這種制劑應(yīng)被視為對健康有潛在危害。應(yīng)根據(jù)您自己實驗室的安全程序使用和丟棄它。此類安全程序應(yīng)包括戴防護手套和避免產(chǎn)生氣溶膠。打開安瓿或小瓶時應(yīng)小心謹慎，以免割傷。

NIBSC 97/564 百日咳桿菌抗FHA血清(標準品)

3. 單元

沒有為該材料分配單元

4. 內(nèi)容

生物材料原產(chǎn)國：英國。

每個小瓶含有 1.0ml 0.01M 磷酸鉀 pH7.2、0.5M NaCl 溶液的凍干殘余物，該溶液含有通過用 50% 飽和硫酸銨沉淀抗百日咳桿菌 FHA 血清而純化的免疫球蛋白。

5. 存儲

未開封的小瓶應(yīng)儲存在 -20°C。

請注意：由于凍干材料固有的穩(wěn)定性，NIBSC 可能會在環(huán)境溫度下運輸這些材料。

6. 開瓶指南

樣品瓶有一個“上翻式"圓形瓶蓋。無論是在瓶蓋上還是在小瓶的套環(huán)上，都標有撬開瓶蓋的位置。這暴露了塞子的一個區(qū)域，通過該區(qū)域重構(gòu)可以使用皮下注射針頭和注射器提取制劑。如果首先 使用移液器，則使用鑷子等*取下金屬項圈，戴上合適的手套注意避免割傷。取下塞子以便進入。應(yīng)注意防止內(nèi)容物丟失。

NIBSC 97/564 百日咳桿菌抗FHA血清(標準品)

7. 材料的使用

出于實用目的，每個小瓶都含有相同數(shù)量的抗血清。每個小瓶的全部內(nèi)容物應(yīng)*重新懸浮在準確測量量的水或緩沖溶液中。不應(yīng)試圖權(quán)衡其中的比例凍干粉。

如果不立即使用，建議將懸浮液儲存在 –20°C 或以下。應(yīng)避免反復凍融。小瓶不含抑菌劑，不應(yīng)假定制劑是無菌的。

用于綿羊免疫的抗原是純化的絲狀血凝素，它是由比利時 Rixensart 的 SmithKline Beecham Pharmaceuticals 通過 M Duchene 博士的斡旋慷慨捐贈的。用弗氏*佐劑 (FCA) 乳化的磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中的一劑 250µg 抗原 (PBS) 以 2ml 的總體積肌肉注射給綿羊，然后每隔 4 周注射三劑 150µg 抗原。最后一次注射后 2 周進行終末放血。通過用50％飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白來部分純化血清。

將沉淀物重新懸浮在PBS中并將懸浮液以1ml等分試樣分配到小瓶中并凍干。通過ELISA檢查抗血清對同源抗原的反應(yīng)性和與其他百日咳抗原的交叉反應(yīng)。在 1/10,000 的稀釋度下，抗血清給出了同源滴度，并且與其他百日咳抗原沒有交叉反應(yīng)。

酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb
二.甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。
三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。
四.異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）
五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應(yīng)。
七.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。